貼壁細胞消化傳代中常見問題

貼壁細胞消化傳代時通常采用兩種方法：

一、加入胰酶等細胞脫落后，再加培養(yǎng)基中止胰酶作用，離心傳代；

二、加入胰酶后，鏡下觀察待細胞始脫落時，棄胰酶，加培養(yǎng)液分瓶。但前者太麻煩，而后者有可能對細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的細胞先脫落，對腫瘤細胞來說，這部分細胞有可能是惡性程度較高的細胞亞群。

 介紹一種簡單的消化傳代方法和各位共享。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據(jù)細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將細胞消化單細胞。

 1、洗去血清 

 2、加1/5V PBS/D-Hank‘s，2到3次

 3、1/10V 胰酶  

4、鏡下觀察，見突起縮回（細胞間隙增大）即加含血清培液 

5、吹打后（加培液）

6、分種   

對于較難消化的細胞，可以用2%利多卡因消化5-8分鐘，然后再棄去，加培養(yǎng)基吹打也可以，對細胞的影響不大。  

1、棄去舊培養(yǎng)液，PBS或D液清洗2－3遍（除去舊培養(yǎng)液中血清的影響）； 

2、加入0.125% (0.25%也可以) 胰酶6滴（25cm2的培養(yǎng)瓶），使胰酶剛剛可以布滿整個底；  3、作用1min左右,用含10%血清的培養(yǎng)液3-5ml中和； 

4、輕柔吹打細胞脫壁, 離心。

贊同不用PBS也不用Hanks洗，只要把舊培養(yǎng)液吸的干凈一點，直接加酶消化應(yīng)該不會有什么問題。  

對付難消化細胞的做法是棄取培養(yǎng)液后，用0.04%的EDTA沖洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min，棄取大部分EDTA，加入與剩余EDTA等量的胰酶（預(yù)熱）總體積1/10v。消化到有細胞脫落。不過有人說EDTA對細胞不好。

 EDTA對細胞有損傷作用，一般在難消化的細胞才和胰酶合用，用了EDTA后把細胞離心后洗幾遍洗去EDTA。 

 首先，EDTA對細胞肯定有傷害，EDTA可以與細胞膜上很多大分子蛋白上的中金屬成分發(fā)生螯合，致使蛋白變性影響蛋白質(zhì)的生物活性而發(fā)生損傷。         

 但是，這種損傷是可逆的。就細胞傳代所用的濃度和時間條件下，還不致對細胞產(chǎn)生過大影響。其實Hyclone的胰酶中就有EDTA。          

因此在一般細胞操作中不能用TE代替PBS洗細胞。                         

培養(yǎng)的BASMC：倒掉舊培養(yǎng)液，加入少量胰酶沖一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入適量新培養(yǎng)基中和，并分瓶 這種方法簡單、省事；效果很好并且不損失細胞！ 

問題1：  我的細胞消化要用EDTA加胰酶消化20分鐘，有什么好辦法？ 

解答1：  先用PBS把細胞洗兩遍，使瓶內(nèi)沒有血清了，減少對胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在細胞有些消化下來時，拿著瓶口，運用手腕的力量輕輕震蕩瓶內(nèi)液體，這樣細胞很快就下來了，還不需要吹打，分散也均勻 

問題2：  消化細胞后都用什么洗滌呀？帶血清的PBS，還是直接用PBS，或者是用培養(yǎng)液呀？我原代培養(yǎng)的細胞二次接種后總是有些細胞鋪不開，有些又鋪很好，不知是什么問題，求教一下 

解答2：  不管是進口血清或是國產(chǎn)血清，都用PBS直接沖洗三次即可，沒有必要用DMEM或加血清的培養(yǎng)液。見意你查查胰酶消化的原理，本論壇中就有，加了血清胰酶怎么消化呀。                   

細胞鋪不開，原因有二：

一是消化時離心管中的細胞沒有吹打開，解決方法是離心后的細胞加3ml左右的培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，吹打開后，再加培養(yǎng)基，這樣細胞不會成團，培養(yǎng)基太多，細胞不容易吹打開。二是接種時，培養(yǎng)瓶中先加培養(yǎng)基，再接種細胞，接種后輕輕晃動搖勻。先加細胞后加培養(yǎng)基或不晃動搖勻，其結(jié)果就是細胞鋪不開。          

養(yǎng)MSCs，傳代時候胰酶消化過后，用加血清的培養(yǎng)液終止消化，再離心。棄上清夜，再加入含血清培養(yǎng)液，重懸浮細胞，吹打均勻，計數(shù)，安所需密度接種。先用少量培養(yǎng)液，比如1到2ml，潤濕培養(yǎng)瓶，然后再接種細胞原因是如果直接接種細胞的話，肯定有的地方接觸了較多培養(yǎng)液，而有的地方幾乎就沒有培養(yǎng)液，細胞當(dāng)然不會在沒有營養(yǎng)的地方待著了。         

總之，先用少量培養(yǎng)液潤濕應(yīng)該是一個解決辦法。 

我們的觀點為：   

1、不洗的細胞傳代后，次日一般要換液一次，除去沒有貼壁的死細胞．如果是懸浮生長的細胞則不用處理。 

 2、用離心洗滌來出去殘留胰酶是不必要的，增加污染機會，也造成細胞丟失，還會使些一些細胞死亡。 

   問題3：  以前一直養(yǎng)懸浮細胞，現(xiàn)在養(yǎng)貼壁細胞，總感覺消化時間老是把握不好，有時候消化過頭了，損失很多細胞；有時又消化不充分，導(dǎo)致吹打時候困難，懇請各位給予指點！ 

   解答3：  消化時間和細胞類型、消化液的消化能力、細胞的密度等多種因素有關(guān)。一般養(yǎng)一種新的細胞要摸索一下消化時間，掌握細胞消化到什么程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強，配好后可分裝成小管，一次用完，其余凍在－20℃，以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可，可放入培養(yǎng)箱中，因外在37℃時酶的活力高于常溫，有利于縮短消化時間。還有一種方法，就是將胰酶鋪滿瓶底后，輕搖培養(yǎng)瓶，使胰酶與細胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可。細胞生長到覆蓋70～80％瓶底時消化較好，若細胞密度過大則消化后細胞易成團。

     消化時間不應(yīng)超過5分鐘，否則對細胞損害很大。消化液覆蓋細胞，成一薄膜，然后反復(fù)傾斜，使消化液沖刷細胞，當(dāng)細胞收縮，部分細胞脫落時，可用*培養(yǎng)基馬上中和，同時吹打壁上細胞。應(yīng)該沒問題。 消化的時間不能一概而倫，要看你的細胞的種類，即使同一種細胞，在不同的細胞株也回出現(xiàn)消化的時間不同的現(xiàn)象，象我們實驗室以前的VERO細胞就很好消化，一般就是2-3分鐘左右，現(xiàn)在重新拿了一株新的VERO細胞平均每次消化在5分鐘以上；其次要看你配的胰酶的質(zhì)量，如果配的比較好，消化的時候就要好消化一點，反之就久一點。還要在你看到消化過頭的情況下，如果細胞下來的比較多了，這時你把CMF或PBS連同細胞棄去是很浪費的，你還不如就連同CMF或PBS加上營養(yǎng)液一起傳，因為營養(yǎng)液中有血清，胰酶一遇到血清就會自動終止消化，當(dāng)然這樣對你的細胞是有一定的影響的，但是這也是補救的*方法，我消化過頭的時候都是這樣處理的，只要你的血清質(zhì)量夠好，細胞一般都會張的較好。 

   問題4：  本人用胰酶冷消化細胞后，終止消化后，發(fā)現(xiàn)絮狀的組織細胞怎么也吹不散，都不容易移入培養(yǎng)瓶。是為什么呢？ 

   解答4：  我們實驗室使用胰酶消化細胞時胰酶并不預(yù)熱，而是直接從4攝氏度冰箱中取出在室溫中直接使用，對消化效果影響不大。不過我想可能有幾個原因：          

其一：細胞生長過度，也就是在有限的空間里面細胞數(shù)量太多，相同時間內(nèi)消化進行不徹

底，導(dǎo)致大量細胞間連接沒有破壞掉。          

其二：消化時間不夠。          

其三：樓上所說的情況我還沒有經(jīng)歷過，可能也存在吧。不過我想應(yīng)該取決于樓主用胰酶消化的細胞的性質(zhì)。          

在培養(yǎng)人前列腺癌細胞PC-3M時也遇到過類似問題。當(dāng)時是準(zhǔn)備做流式，看藥物對細胞周期和調(diào)亡的影響。首先排除了藥物對細胞的影響，后來發(fā)現(xiàn)可能是由于細胞屬高度轉(zhuǎn)移的細胞系，貼壁不牢，常規(guī)消化會破壞細胞膜，出現(xiàn)非常難吹散的白色絮狀物。于是嘗試了以下兩種方法：1、加入消化液使其撲滿瓶底后迅速將其倒出，縮短消化時間。2、不使用消化液，用培養(yǎng)液直接將貼壁細胞吹打下來。此法會造成細胞丟失，但*避免了消化液消化過度的影響，在細胞量較大時可嘗試。此外，還在文獻上看到常規(guī)消化后，加入含血清的PBS洗細胞，終止殘存消化液的作用，我沒有親自嘗試過。          

其實冷消化和熱消化都無所謂，當(dāng)然一般熱消化會比冷消化要好一點，因為胰酶在加熱時活性高一些，這取決于你的細胞．出現(xiàn)絮狀物可能是你的細胞破碎后DNA釋放造成，你可以試用ＤＮａｓｅ把它裂解掉．我也曾遇見過類似情況，加ＤＮａｓｅ就沒有了．當(dāng)然也可能是其它原因，你可以摸索一下．ＤＮａｓｅ使用濃度一般２０－３０ｕ／ｍｌ，你可以在配胰酶時直接加到胰酶中． 

   問題5：  我培養(yǎng)的是卵巢癌患者腹水中提取的原代腫瘤細胞，現(xiàn)在已經(jīng)鋪滿瓶底。今晚消化傳代時，發(fā)現(xiàn)用胰酶后消化15分鐘，也只有少部分細胞變圓飄起，大部分細胞稍有皺縮，但是貼壁還是很勞。吹打也掉不下來。   我的胰酶是3－28配的，配好后一直放在4度冰箱。是不是胰酶失效了？還是原代細胞就是難消化？

   回答5：  胰酶配好分裝后，置－20度備用，使用之前37水浴溶解，25cm2的培養(yǎng)瓶用2ml的胰酶，所以分裝時，盡量考慮到每次的用量，一次拿出來就用完。避免胰酶反復(fù)凍融超，易失效。       

 胰酶消化時，要在37度培養(yǎng)箱內(nèi)，一般0.25％胰酶2～3分鐘，0.05％胰酶－EDTA 3～5分鐘，貼壁細胞即可*飄起。          

像你這種情況，估計是胰酶失效，3月28到今天4月17日，你只是把胰酶放在4度保存，時間和溫度都不合適。   也有一種可能性：生長狀態(tài)不好的細胞，消化時間也會延長。但我們還沒有消化超過5分鐘還不能work的情況。